Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
Для выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали модифицированный метод фенольно-хлороформной экстракции (Blin N., Stafford D.W. 1976).
В пластиковую пробирку, содержащую Na2ЭДТА (pH=8,0) в качестве антикоагулянта забирали кровь самотеком из локтевой вены в необходимом количестве. Кровь перемешивали в пробирке для предотвращения образования тромбов.
К 0.5 мл цельной крови, содержащей Na2ЭДТА (pH=8,0) в качестве антикоагулянта, добавляли 1 мл стерильной дистиллированной воды, перемешивали и центрифугировали 2 минуты при 10000 об/мин. Полученный осадок лейкоцитов еще дважды ресуспендировали и отмывали в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Полученный осадок растворили в 0,2 мл буфера для протеиназы К (20 mM Tris-HCl; pH=8.0; 10 mM ЭДТА, 150,0 mM NaCl, 1% SDS). После этого добавляли протеиназу К до конечной концентрации 250 мг/мл в растворе. Смесь инкубировали в течение 16 часов при 560С. Экстракцию белков проводили, добавив равный объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 и центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Водную фазу отбирали в новую пробирку. К полученной водной фазе добавляли 2-2.5 объема охлажденного 96% этанола для осаждения ДНК. Полученный осадок ДНК промывали охлажденным 70% этанолом, просушивали на воздухе, и растворяли в 100 мкл стерильного ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl; pH=8.0; 0,5 mM ЭДТА). Качество выделенной ДНК и ее приблизительную концентрацию оценивали с помощью электрофореза в 0.7% агарозном геле.